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組織培養中的清洗、消毒滅菌技術

來源：作者：發布時間：2013-07-20 16:09

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　　1、清洗植物組織培養用的各種玻璃器皿，特別是培養瓶和盛培養基的器皿，一定要嚴格清洗，以防油污、重金屬離子、酸、堿等有害物質殘留在瓶內，影響培養物的生長。使用過的玻璃器皿應及時清洗，先將污物如培養基、培養物倒掉，再浸入水中，然后洗滌。玻璃器皿的洗滌，可根據器皿的污染程度和性質，采用不同的方法，通常有堿洗法和酸洗法。凡有微生物污染的器皿，必須先進行高壓消毒和煮沸，以殺死菌體，否則會產生孢子飛揚，污染環境，給組織培養帶來嚴重困難。器皿洗凈后，應烘干或晾干，放在規定的地方，便于取用。
　　常用的滅菌方法可分為物理的和化學的兩類，即：物理方法如干熱(烘燒和灼燒)、濕熱(常壓或高壓蒸煮)、射線處理(紫外線、超聲波、微波)、過濾、清洗和大量無菌水沖洗等措施；化學方法是使用升汞、甲醛、過氧化氫、高錳酸鉀、來蘇兒、漂白粉、次氯酸鈉、抗菌素、酒精化學藥品處理。這些方法和藥劑要根據工作中的不同材料不同目的適當選用濕熱滅菌（培養基）培養基在制備后的24h內完成滅菌工序。高壓滅菌的原理是：在密閉的蒸鍋內，其中的蒸氣不能外溢，壓力不斷上升，使水的沸點不斷提高，從而鍋內溫度也隨之增加。在o．1MPa的壓力下，鍋內溫度達121℃。在此蒸氣溫度下，可以很快殺死各種細菌及其高度耐熱的芽孢。注意完全排除鍋內空氣，使鍋內全部是水蒸氣，滅菌才能徹底。高壓滅菌放氣有幾種不同的做法，但目的都是要排凈空氣，使鍋內均勻升溫，保證滅菌徹底。常用方法是：關閉放氣閥，通電后，待壓力上升到O．05MPa時，打開放氣閥，放出空氣，待壓力表指針歸零后，再關閉放氣閥。三次放氣后，關閥再通電，壓力表上升達0．1-0．15Mpa時，維持15-20min。o對高壓滅菌后不變質的物品，如無菌水、栽培介質、接種用具，可以延長滅菌時間或提高壓力。而培養基要嚴格遵守保壓時間，既要保壓徹底，又要防止培養基中的成分變質或效力降低，不能隨意延長時間。對于一些布制品，如實驗服、口罩等也可用高壓滅菌。洗凈晾干后用耐高壓塑料袋裝好，高壓滅菌20-30min。高壓滅菌前后的培養基，其pH值下降0.2-0.3單位。高壓后培養基pH值的變化方向和幅度取決于多種因素。在高壓滅菌前用堿調高pH值至預定值的則相反。培養基中成分單一時和培養基中含有高或較高濃度物質時，高壓滅菌后的pH值變化幅度較大，甚至可大于2個pH值單位。環境pH值的變化大于0.5單位就有可能產生明顯的生理影響。高壓滅菌通常會使培養基中的蔗糖水解為單糖，從而改變培養基的滲透壓。在8%-20%蔗糖范圍內，高壓滅菌后的培養基約升高0．43倍。培養基中的鐵在高壓滅菌時會催化蔗糖水解，可使15%-25%的蔗糖水解為葡萄糖和果糖。培養基值小于5.5，其水解量更多，培養基中添加0.1%活性炭時，高壓下蔗糖水解大大增強，添加1%活性炭，蔗糖水解率可達5%。

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　　灼燒滅菌（用于無菌操作的器械）o在無菌操作時，把鑷子、剪子、解剖刀等浸入95%的酒精中，使用之前取出在酒精燈火焰卜灼燒火菌。冷卻后，立即使用。操作中可采用250或500ml的廣口瓶，放入95%的酒精，以便插入工具。
　　干熱滅菌（玻璃器皿及耐熱用具）干熱滅菌是利用烘箱加熱到160-180~C的溫度來殺死微生物。由于在干熱條件下，細菌的營養細胞的抗熱性大為提高，接近芽抱的抗熱水平，通常采用170℃持續90min來滅菌。干熱滅菌的物品要預先洗凈并干燥，工具等要妥為包扎，以免滅菌后取用時重新污染。包扎可用耐高溫的塑料。滅菌時應漸進升溫，達到頂定溫度后記錄時間。烘箱內放置的物品的數量不宜過多，以免妨礙熱對流和穿透，到指定時間斷電后，待充分冷涼，才能打開烘箱，以免因驟冷而使器皿破裂。干熱滅菌能源消耗太大，浪費時間。
　　過濾滅菌（不耐熱的物質）一些生長調節劑，如赤霉素、玉米素、脫落酸和某些維生素是不耐熱的，不能用高壓滅菌處理，通常采用過濾滅菌方法。可用無菌的孔徑0.20-0.45um的硝酸纖維素膜過濾菌類，當溶液通過濾膜后，細菌的細胞和真菌的孢子等因大于濾膜直徑而被阻，在需要過濾滅菌的液體量大時，常使用抽濾裝置；液量小時，可用注射器。使用前對其高壓滅菌，將濾膜裝在注射器的靠針管處，將待過濾的液體裝入注射器，推壓注射器活塞桿，溶液壓出濾膜，從針管壓出的溶液就是無菌溶液。

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　　紫外線和熏蒸滅菌（空間）o(1)紫外線滅菌在接種室、超凈臺上或接種箱里用紫外燈滅菌。紫外線滅菌是利用輻射因子滅菌，細菌吸收紫外線后，蛋白質和核酸發生結構變化，引起細菌的染色體變異，造成死亡。紫外線的波長為200-300nm，其中以260nm的殺菌能力最強，但是由于紫外線的穿透物質的能力很弱，所以只適于空氣和物體表面的滅菌，而且要求距照射物以不超過1.2m為宜。
　　(2)熏蒸滅菌用加熱焚燒、氧化等方法，使化學藥劑變為氣體狀態擴散到空氣中，以殺死空氣和物體表面的微生物。這種方法簡便，只需要把消毒的空間關閉緊密即可。常用熏蒸劑是甲醛，熏蒸時，房間關閉緊密，按5-8ml／m3用量，將甲醛置于廣口容器中，加5g/m3高錳酸鉀氧化揮發。熏蒸時，房間可預先噴濕以加強效果。冰醋酸也可進行加熱熏蒸，但效果不如甲醛。化學消毒劑的種類很多，它們使微生物的蛋白質變性，或競爭其酶系統，或降低其表面張力，增加菌體細胞漿膜的通透性，使細胞破裂或溶解。一般說來，溫度越高，作用時間越長，殺菌效果越好。另外，由于消毒劑必須溶解于水才能發揮作用，所以要制成水溶狀態，如升汞與高錳酸鉀。還有消毒劑的濃度一般是濃度越大，殺菌能力越強，但石炭酸和酒精例外。
　　噴霧滅菌（物體表面）物體表面可用一些藥劑涂擦、噴霧滅菌。如桌面、墻面、雙手、植物材料表面等，可用70%的酒精反復涂擦滅菌，l%-2%的來蘇兒溶液以及0.25%-1%的新潔爾滅也可以。

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　　3、無菌操作
　　植物組織培養是一種無菌技術，因此不僅要求整個操作過程，一切用具、材料、培養基、培養室、工作人員的衣物都要無菌，而且要求工作人員在操作過程中要遵守無菌操作的規程，如少有疏忽，都會造成無法挽回的后果，使工作前功盡棄。工作人員在進行無菌操作是要嚴守以下幾點：
　　a.入無菌室前，要洗手，去掉指甲中的污物。
　　b.入室時要穿上經過消毒的工作服、帽子、口罩和鞋子等。
　　c.操作前要用70的酒精擦洗工作人員的手，操作中要經常用酒精擦洗手。不準講話，亦不準對著操作區呼吸，以免微生物污染材料、培養基和用具。每次重新操作都要把工具在火焰上消毒。
　　d.必須在酒精燈火焰處進行操作，如打開瓶口，轉接材料。蓋瓶蓋前應將瓶口在火焰上燒一下，再將蓋子也在火焰上燒一下，然后蓋上。

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